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若羌县原始胡杨林胡杨内生细菌多样性分析及一株新种的多相分类学鉴定

来源:期刊网  作者: 买孜拉木·肉扎洪  导师: 艾尔肯·热合曼;   时间:2018-05-08 20:52:37  点击:

  本研究利用可培养法和免培养的454高通量测序技术首次对若羌县原始胡杨林胡杨内生细菌的多样性及群落结构进行了初步分析。共从15颗胡杨采取了茎杆液样用于内生菌多样性分析。采用LB、TSA、TSB、MA、BPA、R2A和GLB七种培养基进行分离纯化可培养内生细菌,共分离出233株胡杨可培养内生细菌。菌落和细胞形态观察结果表明,233株菌的菌落颜色大都为白色,占细菌总数的27.5%;简单染色结果表明,大多数菌为杆状,占细菌总数的48.1%;革兰氏反应结果表明,233株菌中革兰氏阴性菌为144株,占细菌总数的60.9%;革兰氏阳性菌为89株,细菌总数的38.2%。

  基于16S r DNA系统发育分析结果表明,233株菌属于细菌域5大系统发育类群,分别为γ-变形菌纲(Gamma-Proteobacteria,129/233,55.36%),厚壁菌门(Firmicutes,83/233,35.62%),α-变形菌纲(Alpha-Proteobacteria,11/233,4.72%),放线菌门(Actinobacteria,8/233,3.43%),拟杆菌门(Bacteroidetes,2/233,0.86%),由录属于29个属的67个物种组成。芽孢杆菌属和假单胞菌属是优势菌群,分别占12.02%和14.59%。其中有65株内生细菌的16S rDNA相似率≤98.65%,它们分属于12个属的25个物种,是胡杨林本源的潜在新菌种。

  本研究同时首次对若羌县原始胡杨林胡杨茎秆液建立了一个454高通量测序分析菌群结构的流程。基于16S rDNA相似性97%为标准,用mothur软件对所有序列进行OTU划分得到了621个OTU,系统发育分析结果表明细菌621个OTU分别归属于酸杆菌门(Acidobacteria),放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),绿菌门(Chlorobi),绿屈挠菌门(Chloroflexi),蓝细菌门(Cyanobacteria),铁还原杆菌门(Deferribacteres),丝状杆菌门(Fibrobacteres),厚壁菌门(Firmicutes),黏胶球形菌门(Lentisphaerae),浮霉状菌门(Planctomycetes),变形杆菌门(Proteobacteria),螺旋体门(Spirochaetes),Synergistetes,软壁菌门(Tenericutes),疣微菌门(Verrucomicrobia), no_rank_Bacteria, unclassified_Bacteria等十八个门。其中拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势类群,占总OTU的42.92%;在纲水平上分类为34个纲,优势纲为Clostridia,占优质序列的26.46%;属水平上分类为125个属,优势属为Proteiniphilum,占优质序列的15.22%;在种水平上分为153个物种,优势种为Proteiniphilum_uncultured_bacterium,占优质序列的11.78%。从分类地位的结果来看,454的16S rDNA533R→27F引物扩增序列反应了更高的多样性。对分离到的潜在新种MA-69T进行多相分类学的鉴定。菌株MA-69T为革兰氏阴性,无运动性,不产孢子,严格好氧,短杆状的细菌。菌株MA-69T在MA培养基上,经30℃下培养3天后,形成直径1.0mm大小的圆形,边缘整齐黄色菌落。细胞大小为(1.5-2.0)um×(0.5-0.7)um。菌株生长温度为25-37℃(最适30℃),pH范围为6.0-9.0(最适pH7.5),NaCl浓度范围为0-3%(w/v)(最适1%)。菌株MA-69T对链霉素(10微克),卡那霉素(30微克),氯霉素(5微克),四环素(30微克),庆大霉素(10微克)敏感。基于16S rRNA序列分析显示,菌株MA-69T属于假单胞菌属,分别与Pseudomonas azotifgens JCM12708T,Pseudomonas balearica DSM6083T及Pseudomonas indica DSM14015T分别有97.46%,97.05%,95.93%的16S rRNA基因序列相似性。菌株MA-69T与Pseudomonas azotifgens JCM12708T,Pseudomonas balearica DSM6083T之间的DNA-DNA杂交率分别为62.9%与49%。菌株MA-69T的(G+C)mol%含量为64.1%。菌株MA-69T的优势脂肪酸成分有C19:0cyclo w8c,C16:0,C12:0,综合特征3与综合特征8。MA-69T的主要的极性脂类型磷脂酰甘油、双磷脂甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和未知的磷脂。MA-69T的主要的醌类型为Q-9。综上所述,基于表型特征、化学分类学特征与系统发育分析,菌株MA-69T是Pseudomonas属内的一个新物种,并提议命名为Pseudomonas tarimense。典型菌株保藏编号为CCTCCAB2013065T=JCM19137T。

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